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सेल-फ्री डीएनए का उपयोग कर प्रत्यारोपण के बाद ठोस अंगों के स्वास्थ्य की निगरानी करना

June 15, 2020

CfDNA पर आधारित निदान ऊतक बायोप्सी को अप्रचलित बना सकता है
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. प्रत्यारोपण के बाद कई सीमाएं होने के बाद एलोग्राफ़्ट अस्वीकृति का पता लगाने के लिए महंगा और आक्रामक ऊतक बायोप्सी। Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. सेल-फ्री डीएनए (cfDNA) पर आधारित एसेस - कोशिकाओं, ऊतकों, और अंगों से निकलने वाले डीएनए के फैलते अंशों के रूप में वे प्राकृतिक कोशिका मृत्यु से गुजरते हैं - हाल ही में गहन अध्ययन किया गया है और अंततः अस्वीकृति का पता लगाने की हमारी क्षमता में सुधार कर सकते हैं, प्रबंधन में कई बदलावों को लागू कर सकते हैं। , और यहां तक ​​कि प्रत्यारोपित अंगों के दीर्घकालिक अस्तित्व को बढ़ाते हैं।
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. CfDNA का मानना ​​है कि पूरे-जीनोम अनुक्रमण (WGS) की आवश्यकता को दरकिनार करते हैं और दाता और / या प्राप्तकर्ता जीनोटाइप के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के शक्तिशाली तार्किक फायदे हैं और वर्तमान में नैदानिक ​​जांच के अधीन हैं। In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. इसके अलावा, प्रत्यारोपण के बाद दाता-व्युत्पन्न cfDNA (dd-cfDNA) के अंग-विशिष्ट कैनेटीक्स के ज्ञान में सुधार ने भी इन assays को अनुकूलित करने में मदद की है। Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. प्रयोगशालाओं ने dd-cfDNA, जैसे कि डिजिटल छोटी बूंद पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) और ऑर्गन-स्पेसिफिक डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न को निर्धारित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों की शुरुआत की है। As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. जैसे, cfDNA पर आधारित न्यूनतम इनवेसिव डायग्नोस्टिक्स का क्षेत्र तेजी से बढ़ रहा है, एक दिन संभावित रूप से पारंपरिक ऊतक बायोप्सी की जगह।
ऑर्गॅन रीजन में CFDNA का रोल
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. अस्वीकृति, प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा प्रणाली की वजह से एक दान किए गए अंग की चोट का जिक्र करते हुए, अलोग्राफ़्ट शिथिलता और यहां तक ​​कि रोगी की मृत्यु भी हो सकती है। T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). टी-सेल मध्यस्थता तीव्र सेलुलर अस्वीकृति (एसीआर) पहले 6 महीनों के बाद प्रत्यारोपण (1) के भीतर सबसे अधिक बार होता है। ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. एसीआर में सीडी 4 + और सीडी 8 + टी-कोशिकाओं का संलयन शामिल होता है, जो कि एलोग्राफ के इंटरस्टीशियल स्पेस में होता है, क्योंकि प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा प्रणाली विदेशी अंग के रूप में दान किए गए अंग को पहचानती है। These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. ये टी-सेल एक प्रतिरक्षा कैस्केड शुरू करते हैं जो अंततः लक्षित कोशिकाओं की क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (एपोप्टोसिस) की ओर जाता है। As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). जैसे ही ये कोशिकाएं मर जाती हैं, जीनोमिक डीएनए को क्लीव किया जाता है और लंबाई में लगभग 140 बेस पेयर (बीपी) को मापने के लिए डीडी-सीएफडीएनए के टुकड़े होते हैं, रक्त में प्राप्तकर्ता सीएफडीएनए के पूल में शामिल होने के लिए जारी होते हैं और अंततः मूत्र (2) में उत्सर्जित होते हैं।
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. परिसंचारी cfDNA को हाल ही में चिकित्सा के अन्य क्षेत्रों में आक्रामक बायोप्सी को बदलने के लिए एक नैदानिक ​​उपकरण के रूप में परिवर्तित किया गया है, जिसमें गर्भाशय में आनुवंशिक असामान्यताओं की पहचान करने के लिए भ्रूण के डीएनए के टुकड़े का विश्लेषण करना और कैंसर से संबंधित उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं से जारी डीएनए का अनुक्रमण करना है। In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). इन दोनों मामलों में और साथ ही प्रत्यारोपण में, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण जो डीएनए अनुक्रम के अंतरों की पहचान और परिमाण करता है, वे अलग-अलग स्रोतों (2) से प्राप्त cfDNA की दो अलग-अलग आबादी के बीच अंतर करते हैं। Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. CfDNA की तीन विशेषताएं ठोस अंग प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकृति का पता लगाने के लिए एक उत्कृष्ट नॉनवॉइसिव उम्मीदवार बायोमार्कर बनाती हैं: इसे एक साधारण रक्त ड्रॉ से प्राप्त किया जा सकता है, इसकी एकाग्रता को सटीक रूप से मापा जाता है, और इसके न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को आसानी से पहचाना जाता है। Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. ACR के लिए एक बायोमार्कर के रूप में cfDNA का उपयोग करना भी लाभप्रद है क्योंकि यह दान किए गए अंग की घायल कोशिकाओं से प्राप्त होता है और इसलिए allograft में होने वाली कोशिका मृत्यु के प्रत्यक्ष माप का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). इसके अलावा, cfDNA मूल जीनोमिक डीएनए की सभी आनुवंशिक विशेषताओं को बनाए रखता है, जिससे दान किए गए अंग से जारी आनुवंशिक सामग्री को प्राकृतिक एपोप्टोसिस (3) से गुजरने वाले प्राप्तकर्ता की कोशिकाओं से प्राप्त विभेदित किया जा सकता है।
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए अलोग्लोटाइप स्वास्थ्य की बार-बार और सटीक निगरानी आवश्यक है। For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). हृदय प्रत्यारोपण (एचटी) के लिए, एंडोमोकार्डियल बायोप्सी (ईएमबी) एसीआर (4) का पता लगाने के लिए वर्तमान सोने का मानक है। However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). हालांकि, ईएमबी महत्वपूर्ण सीमाओं के साथ महंगे हैं, जिनमें से कई सभी अंग बायोप्सी (5-7) के लिए सामान्य हैं। Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). इसके अलावा, EMBs की आक्रामक प्रकृति एचटी रोगियों को जटिलताओं (6,8,9) के लिए जोखिम में डालती है।
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). दुर्भाग्य से, वर्तमान में उपलब्ध इकोकार्डियोग्राफी या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) सहित गैर-संक्रामक विधियां पर्याप्त रूप से अस्वीकृति (10-13) का पता लगाने के लिए पर्याप्त विशिष्टता और संवेदनशीलता का अभाव है। Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). रक्त आधारित बायोमार्कर, जैसे कि cfDNA, एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है जिसे नैदानिक ​​अभ्यास (14-17) में आसानी से लागू किया जा सकता है।
सीएफडीएनए अंकन और प्रतिक्रिया के प्रकार
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). चूंकि cfDNA एपोप्टोसिस की स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रक्रिया से उत्पन्न होता है, इसलिए सभी व्यक्तियों के रक्त (18) में cfDNA का पता लगाने योग्य स्तर होता है। For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. स्वस्थ व्यक्तियों के लिए, परिसंचारी cfDNA का अधिकांश हिस्सा हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं से आता है जो सेलुलर कारोबार से संबंधित प्राकृतिक मृत्यु से गुजर चुके हैं। Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). सीएफडीएनए के स्तर में संक्रमण, सर्जरी, आघात या यहां तक ​​कि संपूर्ण व्यायाम (2,19) सहित कई कारणों से उतार-चढ़ाव होता है। Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. इसलिए, अस्वीकृति का पता लगाने के लिए एक cfDNA- आधारित परख विकसित करने के लिए प्राप्तकर्ता के संचलन के बाद प्रत्यारोपण में dd-cfDNA रिलीज की अपेक्षित कैनेटीक्स का आकलन करने की आवश्यकता होती है। This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). यह विचार विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि समय पर प्रत्यारोपण के बाद dd-cfDNA की रिहाई अंग-विशिष्ट (20-22) है।
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). उदाहरण के लिए, 1 दिन के बाद-HT में dd-cfDNA का औसत स्तर 3.8% 2.3% (20) है। However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). हालांकि, 7 दिनों तक dd-cfDNA का स्तर तेजी से घटा है और लगातार कम (<1%) बना हुआ है। During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. दिल में तीव्र अस्वीकृति के एक प्रकरण के दौरान, dd-cfDNA का स्तर 4% -5% तक बढ़ गया था, जो कि क्वाइलेंस के दौरान देखी गई लगभग 0.06% की आधार रेखा से 4% -5% था। The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). एचटी प्राप्तकर्ताओं के संचलन में देखे गए dd-cfDNA के कैनेटीक्स गुर्दे प्रत्यारोपण (22) के बाद मनाया गया था।
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. इसके विपरीत, द्विपक्षीय फेफड़े के प्रत्यारोपण करने वालों को पहले पोस्टऑपरेटिव दिन 26 d 14% का औसत dd-cfDNA अंश मिला। Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). इसके अलावा, dd-cfDNA में कमी dd-cfDNA के स्तर की विशेषता थी जो पहले सप्ताह के भीतर तेजी से घट गई लेकिन फिर धीमी हो गई और आम तौर पर 1% -3% (21) पर बनी रही। However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. हालांकि, तीव्र अस्वीकृति के एक एपिसोड के दौरान हृदय और गुर्दे के प्रत्यारोपण के समान, dd-cfDNA का स्तर काफी बढ़ गया, जो औसतन 14% -15% तक चढ़ गया।
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. Dd-cfDNA के स्तर में इस परिवर्तनशीलता के लिए ऊतक द्रव्यमान और सेलुलर टर्नओवर की दरों में अंतर प्रारंभिक पोस्ट-ट्रांसप्लांट और विच्छेदन के दौरान जारी किया गया। For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). उदाहरण के लिए, अर्ध-द्विपक्षीय और एकल-फेफड़े के प्रत्यारोपण में dd-cfDNA स्तरों को प्रसारित करने के अंतर को क्रमशः सेलुलर बनाम टर्नओवर के अंतर से समझाया जा सकता है, क्रमशः 107 बनाम 58 सेल / सेकंड, (21)। By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). इसके विपरीत, एक विलुप्त ट्रांसप्लांट किए गए हृदय में, सेलुलर टर्नओवर दर केवल 8 सेल / सेकंड (21-23) है। Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. इस प्रकार, किसी दिए गए ठोस अंग से जुड़े dd-cfDNA के अपेक्षित स्तरों की समझ, अस्वीकृति का पता लगाने वाले अंग-विशिष्ट assays के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए आवश्यक है। Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. एक बार जब किसी विशेष अंग के लिए cfDNA रिलीज के कैनेटीक्स को समझा जाता है, तो dd-cfDNA की सापेक्ष मात्रा को निर्धारित करने के लिए कई तरीके मौजूद होते हैं।
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. प्राप्त करने के लिए रणनीति - वी.एस. DONOR-DERIVED CFDNA डोनर-डिर्वडेड सीएफडीएनए
दाता-प्राप्तकर्ता सेक्स-बेमेल
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). अंग प्रत्यारोपण के लिए जिसमें दाता पुरुष है और प्राप्तकर्ता महिला है, प्राप्तकर्ता के कुल cfDNA पूल (17) के भीतर से dd-cfDNA स्तरों की गणना करने के लिए प्रयोगशालाएं इस सेक्स बेमेल का लाभ उठा सकती हैं। Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). शोधकर्ताओं ने सबसे पहले महिला रीनल ट्रांसप्लांट प्राप्तकर्ताओं से लिए गए मूत्र के नमूनों में इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, जिन्हें पुरुष दाताओं से एक किडनी मिली थी और जब उन्होंने अनुभव किया कि अस्वीकृति ने उनके मूत्र में dd-cfDNA के ऊंचे स्तर का प्रदर्शन किया है, जिसमें विशेष रूप से वाई गुणसूत्र पर पाए गए क्षेत्र शामिल हैं ( 17)। Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. यद्यपि यह दृष्टिकोण allograft में अस्वीकृति के आश्वस्त निदान के लिए अनुमति देता है, दाता और प्राप्तकर्ता के बीच सेक्स-बेमेल अपेक्षाकृत अनैतिक है और सार्वभौमिक रूप से लागू नहीं है।
दाता-प्राप्तकर्ता डीएनए अनुक्रम अंतर
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. एक अंग प्रत्यारोपण को एक जीनोम प्रत्यारोपण भी माना जा सकता है, क्योंकि एक प्रत्यारोपण अंग के भीतर की कोशिकाओं में इसके दाता की आनुवंशिक जानकारी होती है। As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). जैसे, जीनोम ट्रांसप्लांट डायनेमिक्स (जीटीडी) की अवधारणा किसी विशेष स्थान पर दाता और प्राप्तकर्ता के बीच आनुवंशिक अंतर की उपस्थिति पर निर्भर करती है, जो तब परिसंचारी cfDNA (20-24) की उत्पत्ति की पहचान करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). आदर्श रूप से, प्राप्तकर्ता एकल आधार (उदाहरण के लिए, AA) के लिए समरूप होगा और उसी स्थान पर दाता एक अलग आधार (उदाहरण के लिए, GG) के लिए समरूप होगा।
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). व्यक्तियों के बीच आनुवंशिक विषमता को देखते हुए, जीनोम भर में संभावित हजारों जानकारीपूर्ण लोकी को प्राप्तकर्ता cfDNA (20,24) से dd-cfDNA को अलग करने के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का उपयोग करके पूछताछ की जा सकती है। This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. इस अवधारणा को सबसे पहले हृदय दाताओं से बैंक किए गए नमूनों का उपयोग करके सचित्र किया गया था ताकि प्रत्येक दाता प्राप्तकर्ता प्राप्तकर्ता के लिए एक प्राथमिकता दाता जीनोटाइप प्राप्त किया जा सके। After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. प्रत्येक प्राप्तकर्ता से cfDNA को निकालने और अनुक्रमण करने के बाद, दाता-विशिष्ट अणुओं का अंश निर्धारित किया गया था। In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). बायोप्सी-सिद्ध अस्वीकृति घटना से पहले या तुरंत लिए गए नमूनों में, दाता-विशिष्ट एकल न्यूक्लियोटाइड पॉलीमोर्फिज्म (एसएनपी) का अनुपात <1% से बढ़कर 3% -4% (24) हो गया था।
This early retrospective study has now been validated prospectively. इस प्रारंभिक पूर्वव्यापी अध्ययन को अब संभावित रूप से मान्य किया गया है। Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). वयस्क और बाल हृदय और फेफड़े के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं को भर्ती किया गया था और प्रत्येक दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी के लिए जीनोटाइप को डब्ल्यूजीएस के माध्यम से 53,423 सूचनात्मक एसएनपी मार्करों (20) के औसत के साथ प्राप्त किया गया था। Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). कुल मिलाकर, तीव्र अस्वीकृति का शीघ्र पता लगाना, एलोप्लास की तुलना में बेहतर था, पहले खाद्य और औषधि प्रशासन ने गैर-आक्रामक दृष्टिकोण को एचसीआर के बाद ट्रांसक्रिपटॉम विश्लेषण (25) के आधार पर पता लगाने के लिए मंजूरी दे दी थी।
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. शोध से यह भी पता चला है कि डब्ल्यूजीएस न केवल एक ग्राफ्ट के बारे में जानकारी देता है, बल्कि एक मरीज के विएम्स और इम्युनोसुप्रेशन की समग्र स्थिति भी बताता है। This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). यह अन्य assays (26-28) द्वारा अप्राप्य संभावित रूप से महान लाभ का प्रतिनिधित्व करता है।
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. हालांकि, डब्ल्यूजीएस चुनौतियों का सामना करता है जो इसे नैदानिक ​​अभ्यास में नियमित रूप से लागू करने से रोक सकता है। For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. उदाहरण के लिए, जबकि एक प्राप्तकर्ता की आनुवंशिक जानकारी आसानी से प्राप्त की जा सकती है, यह हमेशा एक दाता के लिए सच नहीं है। Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. इसके अलावा, डब्ल्यूजीएस महंगा, श्रम गहन और समय लेने वाला है।
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). एक वैकल्पिक विधि निकाले गए cfDNA के पूल के भीतर पहचाने जाने वाले जीनोटाइप्ड पॉलीमॉर्फिक एसएनपी के एक पैनल को नियुक्त करती है, जिससे दाता के विशिष्ट जीनोटाइप (29) के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. गुर्दे और यकृत प्रत्यारोपण के विपरीत, जो अक्सर निकट संबंधी व्यक्तियों के बीच होता है, हृदय और फेफड़ों के प्रत्यारोपण के लिए दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े आमतौर पर संबंधित नहीं होते हैं। GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. जीटीडी को प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता और दाता दोनों के जीनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है। However, in practice, donor genotype information is often unavailable. हालांकि, व्यवहार में, दाता जीनोटाइप जानकारी अक्सर अनुपलब्ध होती है। Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. यहां, हम इस मुद्दे को एक एल्गोरिथ्म विकसित करके संबोधित करते हैं जो दाता जीनोटाइप के अभाव में dd-cfDNA स्तरों का अनुमान लगाता है। Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. हमारा एल्गोरिथ्म दिल और फेफड़े के अलोग्लोटाइप अस्वीकृति की सटीकता के साथ भविष्यवाणी करता है जो पारंपरिक जीटीडी के समान है। We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. हमने निकट संबंधित प्राप्तकर्ता और दाताओं को संभालने के लिए एल्गोरिथ्म को परिष्कृत किया, एक ऐसा परिदृश्य जो अस्थि मज्जा और गुर्दा प्रत्यारोपण में आम है। We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. हम दिखाते हैं कि अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण करने वाले रोगियों में dd-cfDNA का अनुमान लगाना संभव है, जो एक छिपे हुए मार्कोव मॉडल का उपयोग करके असंबंधित या दाताओं के भाई-बहन हैं। Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. इसलिए, हृदय और फेफड़ों के प्रत्यारोपण के लिए एल्गोरिदम विकसित किए गए हैं जो मानते हैं कि दाता का जीनोटाइप सामान्य आबादी के समान आवृत्ति पर होता है। Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. इन आवृत्तियों और प्राप्तकर्ता के ज्ञात जीनोटाइप की तुलना के आधार पर, dd-cfDNA के अंश को प्राप्तकर्ता के प्लाज्मा नमूने से पृथक cfDNA के कुल पूल से विश्वसनीय रूप से अनुमानित किया जा सकता है।
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. फेफड़े के प्रत्यारोपण के मामले में, यह एकल-जीनोम मॉडल, जब दाता और प्राप्तकर्ता जीनोटाइप दोनों का उपयोग करने की पद्धति की तुलना में, dd-cfDNA के तुलनीय अंश प्रदान करने के लिए पाया गया था। However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. हालांकि, जब शोधकर्ताओं ने एचटी के लिए इसी एल्गोरिथ्म को लागू किया, तो dd-cfDNA का अनुमानित स्तर फेफड़े के प्रत्यारोपण के रूप में दृढ़ता से सहसंबद्ध नहीं था। This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. यह HT के बाद उपस्थित dd-cfDNA की कम निरपेक्ष मात्रा से संबंधित हो सकता है। This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). यह अंग-विशिष्ट cfDNA कैनेटीक्स का एक और उदाहरण है जो परख परिणामों को प्रभावित कर सकता है और इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए (30)।
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. गुर्दे के प्रत्यारोपण के मामले में, डीएडी-सीएफडीएनए स्तरों की उपयोगिता का पता लगाने के लिए भावी अध्ययन किए गए हैं, जिन्हें पहचाने जाने वाले दाता-विशिष्ट एसएनपी का उपयोग किया जाता है, जो अस्वीकृति के लिए व्यवहार्य मार्कर के रूप में पहचाने जाते हैं। In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). इस तरह के एक अध्ययन में, 384 किडनी प्राप्तकर्ताओं को 14 नैदानिक ​​साइटों से निर्धारित अंतराल पर रक्त के नमूने प्रदान करने के लिए भर्ती किया गया था और नैदानिक ​​रूप से इंगित बायोप्सी (31) के समय पर। Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. कुल मिलाकर, अध्ययन 102 रोगियों से 107 बायोप्सी नमूनों में हिस्टोलॉजी के बीच सहसंबंध पर केंद्रित था और मिलान किए गए प्लाज्मा नमूनों में dd-cfDNA के स्तर को मिला। More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. अधिक विशेष रूप से, सक्रिय अस्वीकृति वाले 27 रोगियों से 27 बायोप्सी नमूने सक्रिय अस्वीकृति के बिना 75 रोगियों से 80 बायोप्सी नमूनों के साथ प्राप्त किए गए थे।
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. इस अध्ययन में, सक्रिय अस्वीकृति में तीव्र एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति (एएमआर), क्रोनिक एएमआर, और एसीआर शामिल थे। The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए परख ने सक्रिय अस्वीकृति की उपस्थिति या अनुपस्थिति को इंगित करने के लिए dd-cfDNA के अंश के लिए 1% कटऑफ नियोजित किया था और 85% विशिष्टता (95% CI, 79% -91%) और 59% संवेदनशीलता पाई गई थी (95% सीआई, 44% -74%)। The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). इस परख की संवेदनशीलता सक्रिय और अनुपस्थित एएमआर के बीच भेदभाव के लिए अधिक थी, क्योंकि 1% dd-cfDNA के कटऑफ के उपयोग में 83% विशिष्टता (95% CI, 78% -89%) और 81% संवेदनशीलता थी। (95% सीआई, 67% -100%)। Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. विशेष रूप से, दोनों मामलों में, संवेदनशीलता में काफी गिरावट आई जब dd-cfDNA का अंश 3% से अधिक हो गया।
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). गुर्दे के प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकृति का पता लगाने के लिए गैर-इनवेसिव cfDNA- आधारित परख की विशिष्टता और संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए, जांचकर्ताओं ने dd-cfDNA (32-33) की पूर्ण मात्रा का सर्वेक्षण भी किया है। By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. Dd-cfDNA की पूर्ण मात्रा में पूछताछ करके, कोई भी अस्वीकृति घटनाओं, जैसे संक्रमण, आघात या व्यायाम के कारण कुल cfDNA स्तरों में वृद्धि के कारण dd-cfDNA के अंश में कृत्रिम परिवर्तनों को समाप्त कर सकता है, संभवतः एक और अधिक बना रहा है। सटीक परख।
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). इस संभावना की जांच करने के लिए, एक अध्ययन ने जनसंख्या आवृत्तियों के आधार पर 32 सूचनात्मक प्रतिलिपि संख्या वेरिएंट (CNV) को नियोजित किया, जैसा कि दिए गए लोकी (32) पर दाता और प्राप्तकर्ता एसएनपी के सापेक्ष अनुपात के विपरीत है। All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. सभी CNV किसी प्राप्तकर्ता के जीनोम के भीतर मौजूद नहीं होते हैं, लेकिन निकाले गए cfDNA के भीतर मौजूद होते हैं, इसलिए उन्हें dd-cfDNA का प्रतिनिधित्व करने के लिए मान लिया गया।
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. दिलचस्प है, जबकि पूर्ण dd-cfDNA स्तरों के उपयोग के साथ समग्रता और संवेदनशीलता में सुधार हुआ है, इस परख में सक्रिय एएमसीआर की उपस्थिति के विपरीत, सक्रिय एएमआर की उपस्थिति और अनुपस्थिति के बीच अंतर करने की क्षमता भी अधिक थी। In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). इसके अलावा, सीरम क्रिएटिनिन का स्तर सक्रिय अस्वीकृति और विच्छेदन के बीच भेदभाव करने के लिए पर्याप्त नहीं था, संभवतः क्योंकि यह ग्लोमेरुलर फ़ंक्शन का अधिक संकेत है, जैसा कि किडनी ऊतक क्षति (31-33) के विपरीत है।
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). एक अन्य अध्ययन ने टैकोलीमुस के स्तरों से संबंधित किडनी प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में dd-cfDNA के निरपेक्ष स्तर का पता लगाया, जो एक इम्यूनोसप्रेसेन्ट (33) है। Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. यहाँ, शोधकर्ताओं ने पाया कि dd-cfDNA की पूर्ण मात्रा कम टॉक्सोलिमस स्तर (<8 μg / L) के साथ रोगियों में उच्च दवा के स्तर की तुलना में काफी अधिक थी। These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. ये आंकड़े बताते हैं कि dd-cfDNA के स्तर में अपर्याप्त इम्युनोसुप्रेशन के परिणामस्वरूप होने वाली allograft चोट का पता लगाने की क्षमता है।
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. प्रयोगशालाओं ने डब्ल्यूजीएस के विकल्प भी प्रस्तावित किए हैं। Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). हमारे समूह ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पैनल, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और एक उपन्यास एल्गोरिथ्म (34) का उपयोग करते हुए 124 अत्यधिक बहुरूपी (मामूली एलील आवृत्ति [MAF]> 0.4) SNPs के लक्षित अनुक्रमण की खोज की। This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. इस दृष्टिकोण ने आवश्यक अनुक्रमण की कुल मात्रा को कम किया, लागत और परख के समय को कम किया और तेजी से विश्लेषण को सक्षम किया। However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. हालांकि, चूंकि यह परख व्यक्तियों के बीच MAF में अंतर पर निर्भर करता है, यह निकटता से संबंधित दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े के लिए मजबूत नहीं होगा, जैसे कि जीवित-संबंधित गुर्दा दान में देखा जाता है। It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. यह मध्यम या अधिक अस्वीकृति घटनाओं का पता लगाने के लिए मान्य किया जाना बाकी है।
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). प्रयोगशालाओं ने भी पॉलीमॉर्फिक एसएनपी का उपयोग करके पता लगाया है कि डिजिटल ड्रॉप्लेट पीसीआर (30,35-37) की तकनीक के साथ संयुक्त dd-cfDNA को निर्धारित करने के लिए। Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). 41 अत्यधिक बहुरूपी एसएनपी का उपयोग करते हुए, स्थिर गुर्दे और एचटी प्राप्तकर्ताओं ने स्थिर यकृत प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के साथ 7% (35) के स्तर के साथ 2% -3% के dd-cfDNA अंश दिखाए।
निष्कर्ष
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. Allograft अस्वीकृति का पता लगाने के लिए एक महंगी और आक्रामक ऊतक बायोप्सी के उपयोग की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. इस तरह, एक न्यूनतम इनवेसिव परख जो पूरे प्रतिरोपित अंग के स्वास्थ्य का प्रत्यक्ष और सटीक आकलन कर सकता है, ठोस अंग प्रत्यारोपण में एक पवित्र ग्रिल का प्रतिनिधित्व करता है।
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. प्रत्यारोपण के बाद cfDNA के उपयोग ने कुछ प्रारंभिक वादा दिखाया है, लेकिन आगे के अध्ययन और सत्यापन के लिए cfDNA के दोनों मूल जीव विज्ञान के साथ-साथ इसके व्यवहार के बाद प्रत्यारोपण की हमारी समझ में सुधार करना आवश्यक है। At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. इस समय, यह स्पष्ट है कि महत्वपूर्ण अंग-विशिष्ट अंतर मौजूद हैं, और cfDNA रिलीज़ के पैटर्न अस्वीकृति के प्रकार के आधार पर भी भिन्न हो सकते हैं। However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. हालांकि, cfDNA एक सबसे होनहार तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है जो अभी तक पूरक या यहां तक ​​कि ऊतक बायोप्सी को बदलने के लिए विकसित किया गया है।